本文主要介绍糖肽搜库结果的解析思路,帮助分析学家从复杂的质谱数据中快速筛选出正确的糖肽结果。
一般思路
由于糖基化的复杂性,分析学家需要从更广泛的视角进行数据判别,包括聚糖的数据库选择,生物学意义,MS2光谱等。
当您获得了糖肽搜库结果,可按照如下步骤进行数据分析:
- 首先根据肽段对结果进行排序,再根据保留时间进行排序。您可以将肽段的电荷态Combine,看看其分布是否符合预期?
- 查看肽段组的聚糖是否与某个合理的构建途径相关?糖肽的保留时间是否合理?
- 检查那些归属不明确的MS2,以确保分配了正确的聚糖。糖基化的肽段往往会导致肽骨架的碎裂效果不佳,因此仅依靠打分来进行解析可能会忽略掉一些真正的阳性谱图。因此,通常需要对MS2质谱图进行手动解析。
搜索设置
选择正确的数据库:一种组织表达系统可能会产生与另一种系统不同的聚糖。最常见的错误原因之一,就是正确聚糖不在搜库范围内。
检查肽段组
- 聚糖生物学意义
查看组中评分最高的结果,并确保所有其他结果在该背景下都有意义。
肽段组中鉴定出的聚糖相互之间是否存在依存关系?如您经常会在同一位点看到高甘露糖和复杂的唾液酸化形式。
- 糖肽保留时间
NeuAc和其他唾液酸可导致色谱峰向更酸性的区域偏移。您在数据中看到这种情况了吗?如果没有,则表明鉴定结果可能存在问题。
评估其他通过洗脱时间提供的信息,例如当取代基(如唾液酸)从一个天线移动到另一个天线时出现的双峰。
评估MS2
- 在大多数糖肽的碰撞MS2质谱中,您应能看到 HexNAc (204) 和 HexNAcHex (366) 的信号。如果您没有看到这些碎片,但是鉴定结果包含这些结构单元,可能就不是糖肽。
- 确保肽段的N端和C端正确。如果末端不正确,那么一个被认为是截短的肽段可能实际上是一个全长肽链,只是携带了不同的糖基修饰。寻找覆盖末端的 b/y 离子;或者携带小聚糖碎片的完整肽,在合适的能量下进行HCD/QTOF碎裂,Y0和Y1均为可靠的峰。
- 仔细检查Delta Score较低的谱图,因为这表明Byonic找到了另一种不同的匹配结果。
- 请注意标有波浪号(例如 ~y5)的碎片,这表明这些碎片已经完全丢失了聚糖(或其他不稳定的物质)。虽然这是合理且预料之中的,但在缺乏其他确认信息的情况下,这也有助于定位糖基化位点。
MS2质谱示例