糖肽的分析是蛋白翻译后修饰中相对复杂和困难的一个类型。一方面能够用于糖肽分析的商业化软件非常少,另一方面,对于刚刚接触糖肽分析的技术人员来说,糖肽的复杂程度和它与常规肽段在分析上区别常常成为我们分析糖肽的拦路虎。本期的文章我们将为大家介绍一下在Byos当中我们一些常用于糖肽检索结果判定的工具和技巧,以帮助您判断糖肽搜索结果。
糖肽结果验证我们首先要有一个分析的思路,通常在做糖肽分析的时候,我们会建议大家不要急于去从最终的结果中做判断,而是回到数据处理的开始,仔细的考虑一下,你的搜库参数是否设置合理?以及你的糖链数据库的选择是否是正确的?只有在正确和合理的参数和数据库的前提下,我们对结果的验证才是有意义的,数据处理之前没有做好这些准备工作,分析数据就是事倍功半甚至徒劳而返。一切就绪,软件搜库结果满意并开始查看结果后,应该避免在一开始就关注每一条肽段和谱图,而应该结合数据对整体的结果做一个大概的判断。我们的建议比如首先可以先按肽段排序结果,然后按保留时间排序。除此之外,可以将肽段的不同电荷状态合并在一起,以查看电荷状态分布是否符合预期。然后,就可以对排序分组后的肽段数据进行第一遍分析,同样,确保保留时间对糖肽的分析也是非常有意义。后文中我们会详细介绍分析的思路。
质谱是根据肽段和修饰的分子量变化对其进行定性和匹配,但是糖基化修饰是按照生物体内固定合成途径构建的,因此,当我们查看一组糖肽的结果的时候,它们的结构是否与合理的合成途径有关?分析人员本身的生物学背景知识对于糖肽的分析来说也是非常有用的工具,对于最终修饰到功能相关的分析都是非常有意义的。
最后,才是检查MS2谱图,通过对碎片离子的确认以确保分配了正确的糖基化修饰和位点。糖基化的肽通常的肽骨架断裂效率很低,仅依靠肽段碎片打分进行验证可能会导致标准过高从而忽略了正确的糖肽谱图。因此,通常糖肽MS2谱图的判断要综合考虑肽链碎片和糖链碎片,并且需要进一步手动验证MS2谱图,通过手动验证的结果将作为糖肽结果的一部分。
搜索设置中,您可以使用“Show all N-glycans”复选框最大化糖肽的定性结果,选择之后软件将不对糖肽结果进行数据的卡值。
Byos v3.8开始,新的MS / MS过滤功能是就对于糖基化修饰的分析特别有意义。此功能使您可以创建MS / MS Peak过滤器,以排除不包含预期诊断离子的谱图。如下图所示,您可以将搜索范围缩小到仅包括一些可预测的糖链碎片离子(204或366)的MS / MS谱图。您还可以配置匹配质量容差和必须包含的预期诊断离子数目。
检索参数设置
首先,在Byos中点击“Help→Online Resources”(将打开“resource”网页),可以访问有关设置N-linked和O-linked糖基化修饰检索参数的两个相关Application Notes(如果您现在还不是我们的用户,可以通过微信公众号右下角登记信息或联系support@proteinmetrics.com获取相关应用)。
第二,选择正确的糖基化修饰数据库,一个物种会产生与另一种物种不同的糖基化修饰类型。Byos/Byonic包括几个不同的糖基化修饰数据库供您选择,包括人,哺乳动物,昆虫,真菌等。这一点特别重要,因为最常见的错误原因之一就是由于所选数据库中缺少正确的糖基化修饰类型,当缺失正确的修饰的时候,自然也不能搜索到正确糖肽。
第三,我们的数据库是开放的,易于编辑和扩展,所以您可以基于文献或您的生物学知识在原有基础上进一步修改糖基化修饰的数据库,使它更加符合您研究的需求和生物样本的实际情况。
检查肽段
首先,在Byos中按照肽段对结果进行排序。查看每一组得分最高的结果,并确保该肽段所有其他修饰结果在该情况下有意义。是否这条肽段鉴定出的所有糖基化修饰是有相关性的?比如,我们经常会在同一个位点同时看到高甘露糖和复杂的唾液酸修饰形式。
第二,在Byos中按洗脱时间排列的数据,将保留时间错误的肽段结果丢掉。一般NeuAc和其他唾液酸可能会导致糖肽色谱出峰往酸性区域漂移几分钟。您是否也在数据中看到这种情况?如果不是,则该定性的结果可能有问题。洗脱时间也能存在其他的线索,例如当唾液酸等从一个天线移动到另一个天线时,存在双峰等现象也可以成为我们判断糖型的一个线索。
评估MS2
首先,对于软件的检索来说,得分的提高是证明匹配更好的证据,但是诊断离子也是我们判断的重要指征。在大多数糖肽的CID或HCD的MS2谱图中,一般能够看到HexNAc(204)和HexNAcHex(366)等信号。如果您的谱图没有看到这些片段,但是具有包含这些结构单元,说明这个匹配结果可能不是该糖肽。
第二,我们需要知道同样的分子量对于糖基化修饰可能存在不同的结构组成。
对于较小的糖基化修饰,尽管质量数确实可以推测糖链组成,但对于给定的组成,可能会有多个结构。当糖链进一步增大且质量大于约4000 Th时,则可能存在质量非常接近(相距<0.1 Th)的不同糖链,这也会使鉴定变得更加复杂。比如NeuAc可以与两个Fuc混淆,或者在一条同时有氧化修饰的糖基化肽段上可能修饰直接被认为是NeuGc而不是Oxidation+NeuAc,因此如果需要,我们应该检查是否存在274和290等特征碎片。尽管较新版本的软件(3.7及更高版本)对不包含274的含NeuAc和不包含290的NeuGc增加了惩罚性打分,以最大程度地减少错配的情况的发生,但是我们依然建议在可能的情况下分析人员应当尽可能进行人工的复核和确认。
第三,仔细检查Delta Scores和Delta Mod Scores分数较低的谱图,因为它们表明Byonic找到了另一种可以匹配的肽段结果,这个结果的差异跟打分最高的结果并不是很大。
第四,确保肽段的N-和C-末端正确。如果它们不正确,则带有糖基化修饰的截短肽可能实际是带有另一个修饰的全长肽段。对于这种情况我们可以寻找能够覆盖末端的b-和y-离子。或者寻找仍带有小的糖链片段的完整肽段,这也暗示我们拥有正确的肽段并有助于定位。一般来说使用优化能量的HCD / CID碎裂,裸肽和裸肽+GlcNAc或GalNAc是可信的峰。
第五,如果你想更加深入的确定糖型信息,可以寻找包含糖链或部分糖链的碎片离子。这些片段可能帮助你确认糖基化的位点和结构。同时请特别注意标有~的片段(例如〜y5),这些片段表示该碎片是已完全失去糖链(或其他不稳定修饰)的片段。尽管这在CID/HCD碎裂模式下是非常正常的情况,但在没有其他确认和辅助信息的情况下,这也可能表示该位点的确认可能存在问题,这在O-糖肽的分析时非常普遍。
一些样品MS2光谱
结语
一名出色的分析科学家,一方面我们需要好的软件帮助我们做判断,给我们提供更多分析数据的思路和便利性,另一方面良好的数据分析习惯对于结果也是非常重要的。一篇小小的文章可能不足以涵盖糖肽分析的方方面面,也有很多受限于作者知识的不足之处,但是如果能够在糖肽的分析中把握到上述的思路一步一步完成我们的分析结果,相信能够对大家的日常分析有一定的帮助!