摘要
- 本技术简介阐述了如何将来自不同实验的正交信息结合在一起以进行生物制剂表征
- 生物治疗药物管线的变化意味着拥有面向未来的 LCMS 工作流程平台非常有利
- 实现分析自动化可有效减轻质谱专家的工作负担，同时保持结果的一致性。
前言
过去面临的与多聚糖和肽图分析相关的挑战
- 耗时：选择峰并与理论多聚糖/肽质量数匹配的过程繁琐，需要手动进行
- 即使存在 MS/MS 数据，也难以利用。目前，主要基于 MS1 进行分析
- 这种技术容易出现手动输入错误（例如，手动输入分子量、错误标注峰等）。
- 峰归属未采用一致的阈值，导致不同分析人员得到的结果存在主观性
- 难以验证数据，并且需要验证的数据量非常大
通常，当自动化作为一个课题提出时，其重点主要在于提高效率，但基于软件的自动化还能够同时改善结果的质量和一致性。
生物药物产品表征先前主要依赖于多种分析，包括肽图分析、亚基分析、游离多聚糖分析和完整分子量分析。最近，其他技术提供了对产品更全面的了解，这些技术包括序列变异体分析（SVA）、宿主细胞蛋白表征（HCP）、热点分析（Hotspot）。通过使用MAM 和其他增强表征筛选方法，质谱技术也越来越多地应用于生物工艺和配方支持。随着分析次数的增加，越来越多的样品以及愈发复杂的分析方式有待研究。在这种情况下，手动数据处理已经不足以满足需求，因此需要借助自动化数据处理与报告以确保效率、质量和一致性。
实验条件
样品处理和分析
对于肽图分析，使用 Lys C 对抗体样品进行酶解，然后进行反相 HPLC-UV-MS 分析。
对于多聚糖分析，使用 PNGaseF 对抗体样品进行 N-糖酶切，然后用 2-AB 标记游离多聚糖。利用 HILIC-FLR-MS 分析游离多聚糖。
数据处理
针对常见分析，使用 Byos® 按照预配置的工作流程对数据进行处理。
对于游离多聚糖分析，采用分离的多聚糖 (IgG) 工作流程。该工作流程引导用户执行的步骤如图 1 所示。可定义所需的多聚糖命名法以匹配首选注释，并且可以使用 Byos 中提供的可编辑列表。图 1 所示的所有数据处理步骤均可另存为预设的工作流程文件，以便将来作为模板使用。
图 1. 分离的多聚糖工作流程概览。
对于肽图分析，使用参考色谱工作流程（如图 2 所示）设置后续数据集的参考点。将肽 UV 色谱图中的峰用 H（重链）或 L（轻链）以及表示肽在肽链计算机模拟酶解中的位置的数字标注。为了比较不同进样的数据（肽图分析或多聚糖分析），使用比较工作流程。
图 2. 肽图分析工作流程概览。带有*标记的步骤不存在于游离多聚糖工作流程中。
使用 PTM（in silico）工作流程进行额外的数据验证。使用预期糖型或肽修饰列表自动生成所有组分的提取离子色谱图。然后将提取离子色谱图与荧光峰（多聚糖）或 UV 峰（肽）进行比较以确认结果。为确保分析人员使用相同的数据处理和峰识别参数，工作流程可存储这些参数（例如，要使用的最小峰面积）。
图 3. 本研究中为确保数据一致性和质量所使用的峰面积阈值。
结果与讨论
游离多聚糖分配和验证
图 4A 显示了带有首选符号（例如 G0F、G1Fa）的标注的荧光谱图。相应的自动分配的鉴定结果列于图 4B 中。为快速检查分配结果，用户可以单击图 4B 中列出的峰顶点时间，针对该峰的积分将显示在荧光色谱图中，通过基线上的粉红色线条表示（图 4A）。此外，还将显示与所选的峰匹配的所有候选物（图 4C）以及质谱图（图 4D）。在图 4 所示的分配结果中，可以看到仅有一个候选鉴定结果（G0F 减去 GlcNAc），质量数准确度为 1 ppm。第二个示例（最大的峰）如图 5 所示。
图 4 A-D. 4A：通过 Byos® 自动标注的游离多聚糖分析的荧光谱图。4B：示出保留时间和分配结果的峰列表。4C：针对所选峰的所有可能的鉴定结果的候选物列表。4D：所选峰的质谱图。
图 5 A-D. 5A：通过 Byos 自动标注的游离多聚糖分析的荧光谱图。5B：示出保留时间和分配结果的峰列表。5C：针对所选峰的所有可能的鉴定结果的候选物列表。5D：所选峰的质谱图。
尽管这些峰分配验证有助于为科学家确保数据处理自动化正确运行，但可以使用时间谱图相似性图来查看相同的信息，如图 6 所示。
在荧光谱图中对三种糖型进行标注：G1-TriF、G1F+NeuAc 和 G2F（图 6A）。来自 PTM（in silico）工作流程显示每种糖型的提取离子色谱图（图 6B），表明 G1F+NeuAc 种类具有两个峰（在图 6B 中以红色显示）。这些峰中的第二个峰在荧光谱图中未标注，因为它在主 G2F 峰下共洗脱。该荧光峰下的 MS 数据（图 6C）证实了两种鉴定结果：一种是 G1F+NeuAc，另一种是 G2F。该峰已正确标记荧光数据中的共洗脱异构体 G1F+NeuAc，因为 XIC 用于确定最佳色谱峰相关性。在图 6 中，G1F+NeuAc 的提取离子色谱图与约 27.1 min 处的荧光峰（绿色）密切相关，而 G2F 的 XIC 则与约 27.6 分钟处的色谱迹线相关性最高。时间谱图相似性评分和相似性图显示在图 6C 中的谱图右侧。
提取离子色谱峰与荧光峰之间的高相关性以绿色显示（相似性评分为 0.8-1），某些相关性以粉色显示（评分为 0.4-0.8），低相关性则以灰色显示（评分低于 0.4）。因此，G1F+NeuAc 显示为绿色，其具有高相关性；而 G2F 的早洗脱部分则显示为粉色，其相关性较低。这一直观的指标便于快速审查，并且能够减少对重新检查原始数据的需求。
图 6A-C. 使用 PTM（in silico）工作流程验证多聚糖鉴定结果。6A：游离多聚糖的荧光谱图。6B：通过 Byos® 的 PTM（in silico）工作流程自动生成的提取离子色谱图示例。6C：游离多聚糖分析得到的谱图，显示了时间谱图相似性图。
自动报告
图 7 显示了使用针对定制报告设置的模板所自动生成的报告的一部分。图 7 中所示的报告选项卡包括针对该多聚糖分析定制的两列数据。第一列显示在红框中，报告了所观察到的种类的质量数准确度。第二列以蓝色显示，是一种分类系统，其根据丰度的相对百分比将不同多聚糖标记为“主要”、“次要”或“痕量”种类。
除表格和图形输出以外，在报告中纳入项目创建设置的功能对于显示信息的创建方式以及数据的确切来源非常有用。
图 7.多聚糖分析的报告示例，显示了用于定制计算的自定义列。
使用比较色谱工作流程进行可比性评估
色谱工作流程可对不同时间点的样品进行对比分析。图 8 显示了使用“Warp”按钮可将色谱峰按照保留时间对齐，其适用于游离多聚糖或肽图分析比较。
图 8.在色谱比对前（图 8A）和色谱比对后（图 8B）间隔数月分析得到的多聚糖谱图。
图 8C. 通过比较色谱创建的可比性报告示例，其经过定制以显示鉴定出的各种游离多聚糖形式的实测质量数。
使用 PTM（in silico）工作流程进行序列可能性研究
Byos® 的 PTM（in silico）工作流程提供了一种快速简单的方法使用 MS1 数据来验证数据中是否未遗漏任何内容并将 UV 色谱图与质谱数据关联起来。
图 9 显示了在肽图分析中使用该工作流程的两个示例。图 9A 示出带注释的 NIST Mab 的 UV 肽图。如红色圆圈所示，在谱图中对两个 H24d 肽实例（在约 54.5 分钟和 55.5 分钟处）进行了标注。该肽为 PENNY 肽（潜在的 NN/NG 位点），且提取离子色谱图确认了对应于这种肽的 54.5 分钟和55.5 分钟处的峰（图 9B）。
这种类型的相关性可用于在 PTM（in silico）工作流程中使用靶向搜索来检查已知的潜在序列可能性。图 9 中的示例显示了用蓝色圈出的 H25 肽。根据先前的知识，这种肽含有潜在的异构化位点。在 UV 色谱图中（图 9A），未对异构化热点进行标注，因为其低于峰鉴定所需的阈值，并且与 L6 肽相比丰度较低。然而，提取离子色谱图（图 9C）显示在约 59.2 分钟处存在异构化肽，并提供了异构化的相对丰度。
PTM 工作流程可以对序列可能性进行更深入的解析，以确保获得所有质量属性的监测结果。
图 9A-C. 9A. 使用 Byos® 得到的肽图分析 UV 自动标注的 UV 色谱图。9B 显示了 PENNY 肽的 NN/NG 位点的提取离子色谱图。该提取离子色谱图能够验证 UV 色谱图中标记的两个 H24d 实例。9C：H25 异构化位点的提取离子色谱图。
结论
- 本文使用的工作流程组合显示了如何通过自动化工作流程促进 UV 与 MS 信息的关联。
- 使用质谱补充有关共洗脱组分的信息，可确保改善有关低丰度种类的信息
- 可以在用于常规分析的相同工作流程中使用靶向技术检查已知的可能性。
- 高度可定制的报告可针对肽图分析提供所需的格式
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Protein Metrics Inc.，美国加利福尼亚州库比蒂诺