算法简介
目前使用的所有电荷去卷积算法都是迭代算法，这些算法会收敛到去卷积中性质谱以及中性质量的电荷分布，这些分布共同解释观察到的 m/z谱。最广泛使用的去卷积算法是 MaxEnt 和 ReSpect，大约于 30年前开发出来，并授权给大多数质谱仪器制造商。
基于最大熵的算法可以减少背景噪音并解决紧密间隔的质量问题，但为了获得更大熵值，往往引起峰分裂，产生artifacts。例如，在较宽的目标质量范围内，去卷积可能会产生“harmonic”artifacts，即具有比率关系的质量的 m/z 系列的重合，导致真实质量的1/n或n倍的虚假质量峰值； 在相对较窄的目标质量范围内，off-by-one分配也会产生另一种类型的artifacts，即真实质量两侧的小峰。
随着治疗性生物制品复杂性不断提高，artifacts在实际应用中往往具有很大误导性。例如，在双特异性抗体分析中，harmonic artifacts可能被误认为半抗，聚集或者错配；在ADC分析中，off-by-one artifacts可能会导致载药量定量出现偏差。
为了解决这些问题，Protein Metrics开发了“简约”电荷去卷积算法，即用最少数量的中性质量峰解释观察到的m/z谱。简而言之，Protein Metrics使用迭代算法来推断 m/z 谱每个小区间内的电荷混合。 对于第一个去卷积质谱，所有电荷值均设置为同等可能性； 然后根据先前去卷积的质谱计算新的电荷值，并重复该过程。 Protein Metrics对具有许多不同电荷的 m/z 间隔应用了“简约”偏差，因为映射到相同 m/z 的多个真实质量比由电荷不确定性引起的去卷积artifacts少得多。在每次迭代中，该算法都会更新电荷向量，从而提供观察到的 m/z 谱的每个点处的每个电荷的概率。新的电荷向量给出新的去卷积质谱，并且每次迭代都会减少观察到的 m/z 谱与根据最后一组电荷向量和去卷积谱计算的 m/z 谱之间差异的平方和，从而避免artifacts产生。
除此以外，“简约”电荷去卷积算法还支持同位素分辨，变性蛋白，非变性蛋白，寡核苷酸等质谱数据分析。
应用场景
1 同位素分辨质谱数据分析
1.1 参数设置
同位素分辨质谱数据分析需要一组去卷积参数，这将使软件能够保留去卷积图谱中的同位素分辨率，如图1所示：
图 1同位素分辨去卷积参数
对于极高分辨率的数据，用户可以进一步降低值以避免平滑。
为了引导软件来计算单同位素质量，可以使用以下高级参数：
[Intact]
MaxMonoisotope=30000
这个参数认为质量小于30000，质量峰是同位素分辨的；质量大于30000，质量峰是非同位素分辨的。
1.2案例分享
以40碱基寡核苷酸（单同位素分子量12286.11）为例，解读同位素分辨质谱数据可视化界面。
由图2a所示，Byos可自动标识寡核苷酸中的主峰（Oligo 40-mer，Reference）和已知杂质；图2b是主峰放大图，黄色和绿色钻石分别表示单同位素分子量和平均分子量。
图 2寡核苷酸去卷积图谱
由图3a所示，任意选择去卷积图谱中5个质量峰，软件自动生成右侧对应的Mass XIC洗脱图谱；由图3b所示，保留时间与分子量呈现正相关，这也与寡核苷酸色谱保留行为一致，因此通过洗脱图谱可进一步验证去卷积结果的正确性。
图 3洗脱图谱
由图4a所示，软件支持Top-Down分析，并自动标识MS2碎片离子，在CID模式下，主要产生a/w系列离子；图4b是母离子放大图，为了使标识更加清晰，软件自动对碎片离子同位素峰簇进行积分得到彩色棒。注意，彩色棒不存在于原始数据中。
图 4寡核苷酸MS2图谱
2 变性蛋白分析
2.1 参数设置
变性蛋白的去卷积分析一般使用默认参数，如图5所示：
图 5变性抗体去卷积参数
如果去卷积图谱上存在杂峰，我们不能确定其存在的真实性，可以通过以下三种方式加以验证：
①更改basic参数中m范围，
②上调Advanced参数中Iteration max，
③使用Advanced command中KnownMassDelta=162.1（如果去卷积图谱中存在这个差值）。
只要杂峰在上述任何一个条件下消失，表明其就是artifacts。
2.2 案例分享
我们以waters mab为例，介绍如何清除去卷积图谱上的杂峰。
如图6a所示，使用默认参数在A处产生了off-by-one artifacts，相邻的主峰之间分子量相差约为162 Da；引入KnownMassDelta，重新计算后，off-by-one artifacts随之消失，如图6b所示：
图 6 KnownMassDelta的去卷积图谱
将Iteration max由10调为30，重新计算后，off-by-one artifacts随之消失，如图7b所示：
图 7 调大Iteration max的去卷积图谱
注意，改变去卷积参数，不影响计算得到的平均分子量结果。
3 非变性蛋白分析
3.1 参数设置
非变性质谱是研究蛋白质复合物相互作用的有效方法。 该技术通常与SEC结合使用，以表征生物治疗药物的尺寸异质性，例如多聚体和剪切体。 然而，由于大质量范围、更少和更低的电荷态以及盐加合物的存在，非变性质谱的去卷积通常面临更大挑战。
Protein Metrics开发了一系列advanced command用以解决这些问题，比如ChargeEnvelopeFilterPower2=true可以给出去卷积图谱中单体和多聚体准确峰高；ChargeEnvelopeWeights=0.1, 0.8, 0.1可引导软件结合3个连续电荷态（默认参数认为目标峰至少含有5个连续电荷态）；SteppingMethod=Linear可以更好地反映质谱仪器的分辨率，并且可以在低质量处生成同位素分辨率的去卷积图谱，在高质量处对中性质谱峰进行平滑。
3.2 案例分享
以MSP1D1_DMPC 磷脂纳米盘为例，介绍高度多分散蛋白去卷积分析方法。
由图8右上角插图所示，MSP1D1_DMPC非变性m/z谱呈宽范围多分散分布并且数据明显重叠，为了进行有效去卷积，在advanced command中添加了CombFilter=5。Byos 允许用户指定一个Comb filter对间隔均匀的delta mass取平均值，DMPC的delta mass为677.5。通过计算得到MSP1D1_DMPC平均分子量 为 141.542 kDa，其中大约有 143 ± 20–30 个 DMPC 分子和 2个MSP（ 分子量为22.4 kDa）分子，与超速离心结果一致。
图 8 MSP1D1_DMPC去卷积图谱
注意，CombFilter 2适用于一系列峰间隔为 162 Da 的糖蛋白；CombFilter 3适用于高度多分散的分子，例如磷脂纳米盘，PEG等。
结论
“简约”电荷去卷积算法可以有效地对寡核苷酸，蛋白质及其复合物质谱数据进行去卷积，支持变性和非变性条件下正负离子电离模式 。
Byos支持Top-Down分析，自动准确标识碎片离子，与传统的Bottom-Up方法相比，在减少数据分析所需的时间方面具有显著优势。