简介
Byos™ 二硫键分析工作流程包括无差别鉴定和定量二硫键连接的肽段（理论和非理论/重组）。本文集介绍了如何使用 Byos 二硫键分析 (S-S) 工作流程（传统 Byonic™ 和 Byologic®）处理 LC/MSMS 数据，并进行检查、定量、样品间比较和报告。
请注意，不需要还原样品的随附数据，拥有非还原酶切样品即可进行分析。
摘要
- 执行 Byos 二硫键 [S-S] 工作流程
- 配置工作流程
- 定义理论的二硫键连接（理论）
- 优化 MS/MS 搜索参数
- 连接蛋白亚基（肽链间）或肽链内二硫键
- 检查结果并生成报告
执行 Byos 二硫键 (S-S) 工作流程
- 单击 S-S 启动工作流程
- 拖放原始数据文件
- 拖放 FASTA 文件
- 从下拉菜单中选择重链和轻链。理论的二硫键列表将会自动生成。
注：理论的二硫键表格可进行编辑。表中的任何二硫键肽段将在 Byologic 肽段表中归类为“Expected”，其他的则仍将继续鉴定，但标记为“Shuffled”。
- 创建一个项目
配置工作流程
使用 Byonic 搜索引擎进行 MSMS 鉴定
Byonic 可轻松地鉴定来自非还原酶切样品的二硫键连接肽段。关于典型的二硫键搜索设置和描述，请参考以下设置
样品酶切选项：
酶切位点（Digestion>Cleavage site(s)）：
胰蛋白酶：“RK”；
胰蛋白酶 + Asp-N 混合酶：“RK;DE”
酶切侧(Digestion>Cleavage side)：
胰蛋白酶：“C 端”；
胰蛋白酶 + Asp-N 混合酶：“C 端；N 端”
酶切特异性(Digestion> Digestion Specificity)：
建议选择完全特异性 (fully specific)。 半特异性搜索将搜索半特异性的基础肽段，但配对肽段始终具有完全特异性。二硫键不支持非特异性分析。如果使用非特异性酶进行酶切，需明确输入最常见的酶切位点（例如 FLWY）并将此选项设置为半特异性。
漏切(Digestion> Missed Cleavages)：“3”或更多。二硫键通常会阻碍常见酶的蛋白水解酶切，因此我们建议将漏切设定为 3 个以上。
修饰：
建议的修饰列表为（Modifications）：
Oxidation / +15.994915 @ M, W | rare1
Deamidated / +0.984016 @ N | rare1
Gln->pyro-Glu / -17.026549 @ NTerm Q | common1
二硫键属于“rare”的修饰类型。我们可以在二硫键肽上搜索修饰，但在确定 common/rare 命名以及设定总最大值时需要格外小心。如果 Total Rare Max 值为 1（如上例所示），并且 Oxidation 和 Deamidation 也被设置为 rare，则 Byonic 将不会搜索修饰后肽段上的 Oxidation 或 Deamidation 修饰。然而，由于 Q-> pyroQ 被设置为 common1，Byonic 将在二硫键肽上搜索 pyroQ 修饰。
请注意，软件仅在基础肽段上搜索修饰，不考虑配对肽段，但是 Byonic 会同时考虑两种肽段作为基础和配对肽段，因此，即使只有一条肽段发生了修饰，软件也能鉴定出二硫键连接的肽段。
如果样品经过烷基化（尽管没有还原），则可以将烷基化剂作为可变修饰加入其中，例如 common2。
S-S, Xlink
“Enable Disulfide”选项已在 S-S 工作流程中勾选。如果三硫键也为目标选项，请勾选“Enable Trisulfide”选项。
在“For FASTA proteins”字段的 FASTA 中输入蛋白位置编号。使用逗号分隔数字，使用分号分隔各组。
示例：“1”表示在 fasta 文件的蛋白 1 中搜索二硫键，包括任意包含半胱氨酸的肽段和其他包含半胱氨酸的肽段之间的连接，包括肽段本身、两个肽段之间的多个二硫键以及肽段内二硫键。“1,2”表示搜索蛋白 1 和 2 之间的链间二硫键，以及蛋白 1 和 2 中的链内二硫键。提示：这是单克隆抗体的常见设置。“1,2;3”表示搜索蛋白 1、蛋白 2 和蛋白 3 的链内二硫键；蛋白 1 和蛋白 2 的链间二硫键，但不搜索蛋白1或蛋白2与蛋白 3 的链间二硫键。
检查和定量
一旦完成鉴定，系统将创建一个项目来验证已鉴定的肽段，将二硫键分类为 Expected 或 Shuffled，进行样品间比较，并生成综合报告。以下是检查结果的最佳实践分步列表。
- 使用项目窗口中的筛选器快速鉴定和排除误报结果
1. 在肽段表中，如果二硫键与另一种修饰共存，并且仅与另一种修饰共存，则将其标记为误报结果 (Ctrl + F)
2. 检查 MS1 同位素剖面并找到蓝点。蓝点是否在单一同位素峰上？如果不是，很可能存在母离子分配的 off-by-one（差一）错误。标记为误报。
3. 检查 MS2。来自基础肽段和配对肽段的碎片离子应添加注释。配对肽段离子将用“(2)”标记在离子标签旁，如下图所示。Byonic 会对基础肽段和配对肽段评分。基础肽段评分可在“Score”列下找到，配对肽段评分可在“X-link Score”列中找到。X-link 评分低可能表示，也可能不表示其鉴定为误报。如果半胱氨酸靠近 C 端，则谱图中可能缺少 y 离子，因此会产生较低、甚至可能为负值的评分。Byonic 评分反映了碎片离子峰的数量、强度和 m/z 误差；低 X-link 评分不一定表示误报结果，因为一个正确的基础肽段（评分较好）连同一个二硫键配对的母离子质量通常足以在含一个蛋白质的样品中作出鉴定。
4. [可选] 如果在一些样品中已鉴定出二硫键连接，但在其他样品中没有，您仍然可以生成 XIC，从而能够对未鉴定样品中的肽段进行定量。单击“Edit -> In-silico Peptides -> Add Missing via Existing Peptides…”
报告
- 单击工具栏中的报告图标或转到“File -> Export -> Report”可生成报告。
- S-S 报告模板会为 Byos 创建的项目自动加载。如果未加载，请转到 File -> Presets -> Report Presets -> Blgc_Std_S-S_Profile.rptc
- 此报告的配置包括：
1. 摘要选项卡，包含蛋白质覆盖率
2. 详细数据透视表，包含所有二硫键肽段 XIC 区域的相对丰度。
3. 提示：如果您希望汇总所有可能的 Cys22-Cys98 连接肽段的 XIC 区域，只需移除Mod. Names 列即可：
4. 总理论 vs. 重组二硫键 XIC 的条形图比较。
5. 总二硫键与三硫键的条形图比较。
6. 根据蛋白质序列中半胱氨酸残基的位置，对肽段、二硫键和其他修饰进行分组的表格。
- 如果您希望将谱图和 XIC 图像纳入其中，请单击“Tabs -> Add Plots”。此步骤可能需要几分钟，具体取决于包含的肽段数量。
- 单击“Export -> Export to PDF…”生成一个包含所有选项卡的单独 PDF 文件。
- 有关如何自定义此报告的更多信息，请参阅我们的相关视频或联系我们。