简介
在生物制药行业中，随着仪器和样品制备技术的不断改进，利用质谱 (MS) 发现、分析和监测宿主细胞蛋白 (HCP) 似乎是一个日益增长的趋势。本技术说明介绍了使用 Byos™（传统 Byonic™ 和 Byologic®）确定 MS/MS 数据中 HCP 的方法。本工作流程提供了聚焦于搜索 HCP 和其他类型蛋白质污染物的处理参数和报告模板。
配置工作流程
蛋白质数据库
用户提供一个 FASTA 文件，其中含有表达该蛋白的生物体的蛋白列表。例如，如果样品在中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞中表达，则可以使用来自“organism:Cricetulus”的蛋白质数据库。我们建议在该数据库中附加表达培养基蛋白（例如牛源性蛋白），包括纯化蛋白的序列，以及在纯化过程中使用的消化酶和其他试剂（例如蛋白 A）。
重复分析
如果数据包含重复项，则使用正确的“Samples Name”（或“MS Alias name”）描述可以帮助 Byos 获得统计数据，可显示在表格或条形图中。设置示例如下所示，其中，“s(…)”代表样品 (sample)，“r(…)”代表重复 (replicate)。
MS/MS 搜索（传统 Byonic™）
Byos HCP 工作流程中的第一个处理节点是 Byonic 进行的 MS/MS 搜索。
搜索 HCP 分析的目标是尽可能地进行蛋白鉴定。HCP 分析的默认参数如下：
- 酶切（Digestion）：胰蛋白酶和完全特异性。半特异性搜索可以鉴定出更多的肽，但根据我们以往的经验，这并不会增加蛋白质鉴定的数量，或影响相对蛋白质定量。
- 碎片离子类型（Fragmenttation Type）：QTOF/HCD。
- 质量容差设置（Mass Tolerance）：母离子和碎片离子分别为 15/20 ppm。用户可以在高质量精度的仪器中降低这些值，或者对于老旧的 TOF/IonTraps 放宽这些值。质量容差也可以由 Protein Metrics,Inc. 的 Preview™ 根据经验确定。
- 可变修饰（Modifications）：出于 HCP 的分析目的，分析人员只需鉴定和定量每种蛋白中最常见的肽段即可。因此，根据样品制备，一套标准的修饰就足以满足需求。例如： （有关“common”和“rare”设置的解释，请参阅 Byonic 手册或 Modification Fine Control应用文集（详见Ptotein metrics官网）。
- 聚糖（Glycans）：Byos 工作流程在搜索中包括了最常见的 N-聚糖。
- 高级设置（Max.# of Precursors per MS2）：虽然很少需要，但根据样品、色谱和 MS 采集设置，搜索可能需要进一步优化。例如，为了分析 DIA 数据，将每个 MS2 的母离子最大数量增加至 6-10。对于短梯度，可将数量增加至 2。对于高度糖基化的 HCP（例如血浆来源的蛋白质），可启用“Show all N-glycopeptides”(在Protein Output Options中进行勾选)。
肽段和蛋白质定量（传统 Byologic®）
通过定量模块功能 (Byologic) 对已鉴定的蛋白质进行定量，并在样品或组分间进行比较。在 Byos 工作流程定量模块节点中可能需要修改的两个参数为：
- Advanced Proteins：默认设置 [auto decoys=2] 意味着所有排名高于诱饵蛋白 2 命中率的蛋白将被包含在结果之中。用户可以将该值增加到 100，从而将得分较低的蛋白纳入到结果之中。
- MS extract options -> m/z Window (ppm)：这是围绕单一同位素的积分窗口宽度（在 MS1 图中显示为粉色区域）。分辨率 15-120k 的仪器设置的典型值为 15-20 ppm，较低分辨率的仪器设置的典型值为 25-50 ppm。
检查结果并创建报告
分析完成后，Byos 会在 Byos 窗口中以选项卡的形式打开一个可视化窗口和一个相应的报告。可视化窗口包括 MS/MS、MS1 和 XIC 图，以及已鉴定的肽段、蛋白质、原始文件和其他项目信息的综合列表。HCP 分析（包括大多数筛选器）的有效输出将显示在报告视图中。
HCP 报告模板配置为对每个蛋白前 3 个强度最高的肽段的 XIC 进行求和。可以将筛选器应用于“Peptide Ranking”列来改变这一操作。例如，如果用户选择 1、2 和 3，那么排名前 3 的肽段将被包括/显示在数据透视表中。
蛋白质鉴定出的肽段不足 3 个可能会产生错误的丰度值。 因此，默认情况下，应用于“Number of peptides”列的筛选器会将这些蛋白质从报告中移除。可通过选中值 1 和 2 来移除这个筛选器。
表格形式的 HCP 数据示例：
相同的数据表示为误差条形图，治疗性产品除外：
若要将质谱和 XIC 图像纳入报告，请单击“Tabs -> Add Plots”。此步骤可能需要几分钟，具体取决于分析中包含的肽段数量。
在导出前隐藏配置字段。
单击“File -> Export -> Export to PDF…”，生成包含所有选项卡的单独 PDF 文件。
在 HCP 项目中使用纯度较低的样品作为基础
极低浓度的肽段经常因其洗脱期间质谱仪未捕获或获得的 MS/MS 谱图质量不佳而无法鉴定。 因此，HCP 分析的一个可行策略是，在 Byos 项目中纳入一个或多个低纯度、HCP含量较高的样品。在混和的样本中，来自丰度更高的蛋白质中的肽段通常更容易鉴定。所以，对于纯度最高的样品是最有利的。重要的是，即使在无法鉴定的情况下，仍可以利用 Byologic 功能：“Edit Menu -> In-silico Peptides -> Add Missing Via Existing Peptides”来产生 XIC。检查时，确保注意低浓度样品与高浓度样品一致的洗脱特征。